Métodos de Detecção e Análise Molecular

 Métodos de Detecção e Análise Molecular

A eletroforese em gel de agarose é uma das técnicas mais utilizadas em biologia molecular para separação, identificação e análise de fragmentos de DNA ou RNA com base em seu tamanho. A separação ocorre pela migração das moléculas carregadas negativamente (devido ao grupamento fosfato dos ácidos nucleicos) em direção ao polo positivo quando submetidas a um campo elétrico, dentro de uma matriz de gel de agarose com poros de tamanho controlável pela concentração de agarose utilizada (tipicamente 0,8 a 3%). Fragmentos menores migram mais rapidamente do que fragmentos maiores. O brometo de etídio (altamente mutagênico) foi historicamente o corante mais utilizado, mas foi substituído por alternativas mais seguras como o SYBR Safe, GelRed e GelGreen. A comparação com marcadores moleculares (ladders) de tamanho conhecido permite estimar o tamanho dos fragmentos. Na rotina diagnóstica, a eletroforese ainda é utilizada para verificar a integridade do RNA extraído, confirmar produtos de PCR convencional e analisar resultados de PCR-RFLP.

A hibridização molecular baseia-se na capacidade de fitas de ácidos nucleicos com sequências complementares de se emparelharem de forma específica, mesmo quando uma das fitas é sintética (sonda). Nessa técnica, uma sonda marcada (com isótopo radioativo, enzima ou fluoróforo) é incubada com o ácido nucleico-alvo em condições controladas de temperatura e concentração salina (stringência), permitindo a detecção específica de sequências de interesse. Entre as aplicações diagnósticas da hibridização destacam-se: o Southern blot (para detecção de sequências específicas em DNA genômico separado por eletroforese); o Northern blot (para análise de mRNA); o FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), que detecta sequências específicas diretamente em cromossomos ou células, sendo amplamente utilizado em oncogenética para detecção de translocações, amplificações e deleções cromossômicas; e os ensaios de captura híbrida (Hybrid Capture), utilizados para detecção qualitativa e semiquantitativa de HPV e outros patógenos.

O sequenciamento de Sanger, desenvolvido por Frederick Sanger em 1977 e aprimorado nos anos 1990 com a fluorescência capilar automática, permanece como padrão ouro para confirmação de variantes genéticas pontuais, tipagem de genes de resistência antimicrobiana, identificação de espécies microbianas pelo gene 16S rRNA (bacteriologia) e ITS (micologia), e análise de regiões hipervariáveis de genes virais. O método baseia-se na incorporação de didesoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados com fluoróforos distintos durante a síntese do DNA, gerando fragmentos de diferentes tamanhos que são separados por eletroforese capilar e detectados por laser. O resultado é um eletroferograma com picos coloridos que representam cada base da sequência. Na rotina laboratorial, o Sanger é utilizado para sequenciar amplicons de 200 a 1000 pb com alta confiabilidade, sendo especialmente indicado quando a variante alvo é conhecida e o número de amostras a analisar é limitado.

O sequenciamento de nova geração (Next-Generation Sequencing, NGS), também denominado sequenciamento de alto desempenho ou sequenciamento massivamente paralelo, revolucionou a genômica ao permitir a análise simultânea de milhões a bilhões de fragmentos de DNA ou RNA em uma única corrida. As plataformas comerciais mais utilizadas na atualidade incluem o Illumina (MiSeq, NextSeq, NovaSeq), o Ion Torrent (Thermo Fisher), o PacBio SMRT e o Oxford Nanopore (para leituras longas). O fluxo de trabalho NGS compreende quatro etapas principais: preparação da biblioteca (fragmentação do DNA/RNA, ligação de adaptadores e, quando necessário, captura de regiões de interesse); sequenciamento (leitura das sequências de bases); análise bioinformática (alinhamento das leituras ao genoma de referência, chamada de variantes, anotação funcional); e interpretação clínica. As aplicações diagnósticas do NGS são vastas: diagnóstico de doenças raras, painel de oncogenética hereditária, perfilamento tumoral, metagenômica clínica para identificação de patógenos desconhecidos, e caracterização de resistomas microbianos. O farmacêutico e o técnico devem compreender os princípios do NGS para garantir a qualidade das etapas pré-analíticas, que são determinantes para o sucesso do sequenciamento.

Os microarranjos genéticos (microarrays ou chips de DNA) consistem em suportes sólidos, lâminas de vidro ou chips de silício, nos quais milhares a milhões de sondas oligonucleotídicas são imobilizadas em posições conhecidas. A amostra biológica, marcada com fluoróforos, é hibridizada ao chip, e a intensidade de fluorescência em cada posição reflete a abundância relativa de cada sequência alvo. Os microarranjos têm sido utilizados para análise de expressão gênica em larga escala, genotipagem de SNPs, detecção de CNVs por array-CGH (Comparative Genomic Hybridization) em citogenômica clínica, tipagem de HPV e detecção de múltiplos patógenos simultaneamente. A validação de resultados em biologia molecular diagnóstica deve incluir o estabelecimento de parâmetros analíticos como sensibilidade analítica (limite de detecção), especificidade analítica (ausência de reações cruzadas com sequências não-alvo), precisão (intra e inter-ensaio), linearidade e robustez, em conformidade com os requisitos da ABNT NBR ISO 15189 e dos guias do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).