Exame de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

 Exame de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

O Ensaio Imunoenzimático (ELISA), também conhecido como Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, é uma técnica imunoenzimática amplamente utilizada em laboratórios de pesquisa e diagnóstico para detectar e quantificar a presença de um antígeno específico ou anticorpo em amostras biológicas. Sua versatilidade, sensibilidade e relativa facilidade de execução o tornam uma ferramenta essencial em diversas áreas da ciência, como medicina, veterinária, biotecnologia, agricultura e meio ambiente.

Histórico e Fundamentos do ELISA

O desenvolvimento do ELISA como técnica laboratorial está intrinsecamente ligado aos avanços na imunologia e nas técnicas de marcação enzimática. O conceito de utilizar enzimas como marcadores em reações imunoquímicas foi explorado pela primeira vez na década de 1960, mas foi em 1971 que Peter Perlmann e Eva Engvall, da Universidade de Estocolmo, publicaram um artigo descrevendo o primeiro ensaio ELISA funcional.

O ELISA se baseia em dois princípios fundamentais:

1. Reação Antígeno-Anticorpo: A reação entre um antígeno e seu anticorpo específico é altamente seletiva e forma um complexo estável. Essa interação é a base da técnica ELISA.

2. Marcação Enzimática: Um dos reagentes (antígeno ou anticorpo) é marcado com uma enzima que catalisa uma reação que produz um produto detectável, como uma mudança de cor ou fluorescência. A quantidade de produto gerado é proporcional à quantidade de antígeno ou anticorpo presente na amostra.

Tipos de ELISA e suas Aplicações

O ELISA abrange diferentes modalidades, cada uma com aplicações específicas em diversas áreas de estudo:

• ELISA Direto: O antígeno é adsorvido à superfície do poço da placa ELISA e o anticorpo específico, conjugado à enzima, se liga diretamente ao antígeno. Esse tipo de ELISA é menos comum, mas pode ser utilizado para detectar antígenos em amostras biológicas.

• ELISA Indireto: O antígeno é adsorvido à superfície do poço e o anticorpo primário específico se liga ao antígeno. Em seguida, um anticorpo secundário, conjugado à enzima e específico para o anticorpo primário, se liga ao complexo antígeno-anticorpo primário. Esse tipo de ELISA é amplamente utilizado para detectar anticorpos em amostras biológicas, como em testes de diagnóstico de doenças infecciosas.

• ELISA Sanduíche: Um anticorpo de captura, específico para o antígeno, é adsorvido à superfície do poço. O antígeno presente na amostra se liga ao anticorpo de captura. Em seguida, um anticorpo de detecção, específico para um epítopo diferente do antígeno, se liga ao complexo antígeno-anticorpo de captura. O anticorpo de detecção pode estar conjugado à enzima (ELISA sanduíche direto) ou um anticorpo secundário conjugado à enzima pode ser utilizado para amplificar o sinal (ELISA sanduíche indireto). Esse tipo de ELISA é amplamente utilizado para quantificar antígenos em amostras biológicas, como hormônios, citocinas e proteínas.

• ELISA Competitivo: O antígeno presente na amostra compete com um antígeno marcado com enzima pela ligação a um anticorpo específico. Quanto maior a quantidade de antígeno na amostra, menor a quantidade de antígeno marcado que se liga ao anticorpo e menor o sinal detectado. Esse tipo de ELISA é utilizado para medir a concentração de pequenas молекулы, como hormônios e drogas.

Técnicas e Ferramentas do ELISA

O ELISA envolve diversas etapas, desde a preparação da amostra biológica até a análise dos resultados:

1. Preparo da Amostra: A amostra biológica (soro, plasma, urina, жидкость cefalorraquidiano, etc.) é preparada de acordo com o protocolo específico do ensaio. Pode ser necessário diluir a amostra, adicionar reagentes ou realizar etapas de centrifugação ou filtração.

2. Adsorção do Antígeno ou Anticorpo de Captura: O antígeno ou anticorpo de captura é adsorvido à superfície do poço da placa ELISA. A adsorção ocorre por interação passiva entre as proteínas e a superfície do poço.

3. Bloqueio: Após a adsorção, é realizada uma etapa de bloqueio para saturar os sítios de ligação não específicos na superfície do poço. Utiliza-se, geralmente, proteínas como albumina bovina ou leite desnatado.

4. Incubação com Anticorpo Primário (se aplicável): No ELISA indireto, o anticorpo primário específico para o antígeno é adicionado ao poço e incubado por um período de tempo determinado.

5. Lavagem: Após a incubação, o poço é lavado para remover o anticorpo primário não ligado.

6. Incubação com Anticorpo Secundário Conjugado à Enzima: O anticorpo secundário, conjugado à enzima e específico para o anticorpo primário (ELISA indireto) ou para o antígeno (ELISA direto ou sanduíche), é adicionado ao poço e incubado.

7. Lavagem: O poço é lavado para remover o anticorpo secundário não ligado.

8. Adição do Substrato: O substrato específico da enzima utilizada é adicionado ao poço. A enzima catalisa a reação que gera um produto detectável, como uma mudança de cor ou fluorescência.

9. Leitura: A absorbância ou fluorescência do produto gerado é medida utilizando um leitor de microplacas. A absorbância ou fluorescência é proporcional à quantidade de antígeno ou anticorpo presente na amostra.

Aplicações do ELISA

O ELISA é uma técnica versátil com aplicações em diversas áreas:

• Diagnóstico de Doenças Infecciosas: O ELISA é amplamente utilizado para detectar anticorpos contra patógenos infecciosos, como HIV, hepatite B e C, dengue, Zika vírus, entre outros.

• Detecção de Autoanticorpos: O ELISA é utilizado para detectar autoanticorpos, que são anticorpos que atacam os próprios tecidos do organismo, e estão associados a doenças autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.

• Quantificação de Hormônios e Citocinas: O ELISA é utilizado para medir a concentração de hormônios, como insulina e cortisol, e citocinas, como TNF-α e IL-6, em amostras biológicas.

• Detecção de Alérgenos: O ELISA é utilizado para detectar alérgenos em alimentos, como amendoim e glúten.

• Monitoramento de Resposta Imune: O ELISA é utilizado para monitorar a resposta imune a vacinas ou transplantes.

Vantagens e Limitações do ELISA

O ELISA apresenta diversas vantagens em relação a outras técnicas imunoenzimáticas:

• Sensibilidade: O ELISA é capaz de detectar pequenas quantidades de antígeno ou anticorpo na amostra.

• Especificidade: A reação antígeno-anticorpo é altamente específica, o que garante a precisão dos resultados.

• Versatilidade: O ELISA pode ser utilizado para detectar diferentes tipos de moléculas, como antígenos, anticorpos, hormônios e citocinas.

• Facilidade de Execução: O ELISA é relativamente fácil de executar e pode ser automatizado.

Apesar das vantagens, o ELISA também apresenta algumas limitações:

• Interferência de Fatores Reumáticos: Em amostras de pacientes com doenças reumáticas, a presença de fatores reumáticos pode interferir nos resultados do ELISA.

• Reações Cruzadas: Em alguns casos, pode ocorrer reações cruzadas entre anticorpos e antígenos semelhantes, o que pode levar a resultados falso-positivos.

• Limitação na Detecção de Isoformas: O ELISA pode não ser capaz de distinguir entre diferentes isoformas de uma mesma proteína.

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O Ensaio Imunoenzimático (ELISA) é uma técnica poderosa e versátil, com aplicações em diversas áreas da ciência. Sua capacidade de detectar e quantificar diferentes tipos de moléculas em amostras biológicas torna o ELISA uma ferramenta fundamental para o diagnóstico de doenças, a pesquisa científica e o desenvolvimento de novas tecnologias.

Com o avanço da tecnologia, o ELISA se torna cada vez mais sensível, específico e automatizado, abrindo novas perspectivas para a compreensão da vida em nível molecular e para o desenvolvimento de novas aplicações que beneficiem a humanidade.