MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

 A Amplificação Dependente de Ligação de Sondas Múltiplas (MLPA) é uma técnica molecular amplamente utilizada para detectar variações no número de cópias de genes e pequenas deleções/duplicações em regiões específicas do DNA. Essa metodologia desempenha um papel fundamental no diagnóstico de doenças genéticas, oncologia e pesquisa biomédica. O presente artigo revisa os princípios teóricos do MLPA, sua metodologia, aplicações clínicas e avanços recentes na área.

 A detecção de variações no número de cópias (Copy Number Variations – CNVs) é essencial para o diagnóstico de diversas doenças genéticas e cânceres. Métodos convencionais, como PCR quantitativo (qPCR) e FISH, apresentam limitações na identificação de alterações genômicas sutis. O MLPA surgiu como uma solução sensível, específica e de alto rendimento para a análise de CNVs e mutações em genes de interesse.

 O MLPA baseia-se no uso de pares de sondas específicas para cada região-alvo do DNA. A técnica permite amplificar múltiplas sequências em uma única reação de PCR, tornando-a altamente eficiente para a detecção de deleções e duplicações gênicas. O princípio central do MLPA envolve as seguintes etapas:

• Hibridização de sondas: Sondas específicas se ligam às regiões-alvo do DNA genômico.

• Ligação das sondas: Uma DNA ligase une as extremidades das sondas pareadas, criando uma sequência contínua.

• Amplificação por PCR: Somente as sondas ligadas são amplificadas, garantindo a especificidade da detecção.

• Eletroforese capilar e análise dos produtos: A intensidade do sinal de fluorescência gerado é comparada com amostras controle para determinar alterações no número de cópias gênicas.

Metodologia do MLPA A realização do MLPA envolve as seguintes etapas principais:

• Preparação da amostra: Extração do DNA genômico a partir de sangue, tecidos ou células.

• Hibridização das sondas: Incubação das sondas específicas com o DNA da amostra.

• Ligação e amplificação: Uso de DNA ligase e PCR para amplificar as regiões-alvo.

• Análise por eletroforese capilar: Separação dos fragmentos amplificados e quantificação da fluorescência relativa.

• Interpretação dos resultados: Comparação com amostras normais para detectar deleções ou duplicações.

Aplicações Clínicas do MLPA O MLPA é amplamente empregado em diversas áreas da biomedicina e genética, incluindo:

• Diagnóstico de doenças genéticas: Identificação de CNVs associadas a síndromes como Distrofia Muscular de Duchenne, Síndrome de DiGeorge e Síndrome de Prader-Willi.

• Oncologia molecular: Análise de alterações em genes supressores tumorais, como BRCA1 e BRCA2, e amplificações oncogênicas.

• Genética reprodutiva: Avaliação de aneuploidias e variações estruturais em embriões para diagnóstico pré-implantacional.

• Neurologia genética: Investigação de alterações genéticas associadas a doenças neuromusculares e neurodegenerativas.

Avanços Recentes e Técnicas Complementares Com o avanço da biotecnologia, novas abordagens vêm sendo desenvolvidas para aprimorar o MLPA e combiná-lo com outras metodologias:

• MLPA Múltiplo (Multiplex MLPA): Permite a análise simultânea de um maior número de genes em uma única reação.

• MLPA combinado com Sequenciamento de Nova Geração (NGS): Proporciona uma visão mais abrangente das variações genômicas.

• Integração com bioinformática: O uso de algoritmos avançados melhora a interpretação dos resultados e reduz falsos positivos/negativos.

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O MLPA revolucionou a análise de variações no número de cópias e pequenas deleções/duplicações, tornando-se uma ferramenta indispensável na genética molecular. Sua alta sensibilidade, especificidade e eficiência o tornam fundamental para diagnóstico clínico e pesquisa biomédica. O contínuo desenvolvimento dessa técnica e sua integração com novas tecnologias continuarão a expandir suas aplicações e precisão diagnóstica.